Zasady syntezy kwasów nukleinowych

Syntezę kwasów nukleinowych przeprowadza się metodą triglicerydów sialamidowych w fazie stałej, polegającą na unieruchomieniu końca 3' DNA na podłożu w fazie stałej i dodawaniu nukleotydów w kierunku od 3' do 5' aż do syntezy pożądanego fragmentu DNA .Różni się to od syntezy DNA zastosowaniem polimerazy DNA.

Koniec 3' pierwszej zasady jest unieruchomiony na CPG podczas syntezy, 5'-OH następnej zasady zabezpiecza się di-p-tolilotritylem DMT, grupa aminowa zasady jest zabezpieczana kwasem benzoesowym, a 3' -OH następnie aktywuje się związkiem aminofosforanowym.1 zasada 5 5′-OH 1 zasady i 3′-OH kolejnej zasady tworzą trigliceryd fosforynowy, który następnie utlenia się jodem do triglicerydu fosforanowego, środek ochronny na drugiej zasadzie 5′-OH usuwa się przez dodawanie kwasu dichlorooctowego DM cyklicznie poprzez dodanie kolejnej zasady, a po syntezie środek zabezpieczający na 5′-OH usuwa się słabym kwasem. Fragment oddziela się od stałej żywicy za pomocą stężonego wodorotlenku amonu, środek zabezpieczający usuwa się z zasady za pomocą stężonego wodorotlenku amonu podczas ogrzewania, wodorotlenek amonu usuwa się, fragment suszy się pod próżnią i kwas nukleinowy oczyszcza się metodą chromatografii cieczowej lub PAGE.

Etapy syntezy oligo

Odblokowywanie

The5-końcową grupę zabezpieczającą DMT usuwa się przez dodanie roztworu TCA.

Aktywacja

Mieszanie aktywatora z monomerem oligonukleotydowym z wytworzeniem aktywnego półproduktu w postaci aktywnego monomeru oligonukleotydowego.

Sprzęganie

5-końcowa grupa hydroksylowa reaguje z aktywnym półproduktem oligonukleotydowym w antygeneratywnej reakcji kondensacji, tworząc niestabilne wiązanie triglicerydowe fosforynowe.

Zakrywanie 

Dodanie środka blokującego powoduje reakcję acetylowania zamykającego z nadmiarem grup hydroksylowych, które nie biorą udziału w reakcji kondensacji.

Utlenianie 

Dodatek roztworu jodu zawierającego wodę reaguje z niestabilnymi wiązaniami fosforynowymi poprzez utlenianie, tworząc stabilne wiązania triglicerydowe kwasu fosforowego.

Rozszczepienie cyjanoetylowe

Produkt kwasu nukleinowego po syntezie, z dodatkiem roztworu DEA w celu usunięcia grupy cyjanoetylowej z wiązania fosforanowo-triglicerydowego.

Rozszczepione i odbezpieczone

Fragmenty kwasu nukleinowego oddziela się od nośnika w fazie stałej przez dodanie stężonego roztworu wodorotlenku amonu, a następnie ogrzewa w celu usunięcia grup zabezpieczających z wiązań wodorowych zasad.